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Elisa試劑盒的三種常見(jiàn)檢測(cè)辦法
發(fā)布時(shí)間： 2020-07-13 點(diǎn)擊次數(shù)： 1096次ELISA測(cè)定形式包括以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競(jìng)賽抑制法，其間競(jìng)賽抑制法(HBeAb,HBcAb等選用)因受操作時(shí)差所引起的不公平競(jìng)賽等因素的影響，成果重復(fù)性較差，質(zhì)量較難操控。不同批次的ELISA試劑在制作過(guò)程中很難確保質(zhì)量*一致，即使是通過(guò)批批檢的項(xiàng)目其檢測(cè)成果也存在差異，因此有必要挑選和訂購(gòu)長(zhǎng)批號(hào)的試劑，并確保保存條件。嚴(yán)格執(zhí)行這一規(guī)范能夠防止因試劑批號(hào)改變而從頭樹(shù)立質(zhì)控體系及從頭評(píng)估試劑的復(fù)雜過(guò)程，而且能夠確保成果的穩(wěn)定性；對(duì)于效期短、使用率低的試劑，應(yīng)當(dāng)小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，防止重復(fù)凍融形成試劑的失效。下面就依據(jù)Elisa試劑盒的三種常見(jiàn)檢測(cè)辦法剖析?下具體原理。歡迎參閱學(xué)習(xí)。問(wèn)：什么是競(jìng)賽性ELISA?答：競(jìng)賽ELISA基于競(jìng)賽結(jié)合技能，即樣本中的待測(cè)分子與固定量的符號(hào)的相同分子（我們一般用堿性磷酸酶作為符號(hào)）同時(shí)與固定在孔板上的抗體的同一結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行競(jìng)賽，參照規(guī)范曲線，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)值是定量的。問(wèn)：什么是夾心ELISA？答：夾層ELISA選用對(duì)樣本中剖析物的特異的抗體作為固定化的捕獲抗體，然后用第二個(gè)帶符號(hào)的抗體作檢測(cè)，檢測(cè)抗體對(duì)剖析物也是專(zhuān)注的。當(dāng)參照規(guī)范曲線時(shí)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)值是定量的。問(wèn)：什么是直接ELISA？答：直接ELISA是將被測(cè)的剖析物直接包膜在微孔板外表，然后用測(cè)驗(yàn)抗體來(lái)證明被測(cè)剖析物的存在。當(dāng)與重組蛋白（規(guī)范曲線）進(jìn)行參照時(shí)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)值是半定量的。Elisa試劑盒的注意事項(xiàng)：正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。實(shí)驗(yàn)條件的選擇在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:（1） 固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。?。?） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg/ml。?。?） 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。（4） 酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
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